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致病菌检测!多种食源性致病菌快速检测方法

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刘晓l文

食品中污染的病原细菌是引起食源性疾病的主要因素之一,每年向卫生部上报的食物中毒人数逐年递增,且大部分是由食源性致病菌引起的.据世界卫生组织估计,全世界每年的食源性疾病患者中,70%都是由致病性微生物引起的.由此可见,食源性疾病与食品污染问题已成为世界范围内举足轻重的公共卫生问题.因此,建立科学、准确、全面的食源性致病菌检测体系,是保障食品安全的重要手段,对预防和控制微生物性食物中毒事件起着重要的作用.

目前对这些食源性致病菌的检测:主要依靠常规的细菌学培养方法,一般需4~7d,操作繁琐,费时耗力,检验的准确度不高,在检测速度、敏感性与特异性等方面也有局限性.随着微生物学的快速发展,食品微生物学检验中引入了越来越多的新技术,有关食源性致病菌检测的免疫磁性分离法、酶联免疫测定方法、核酸杂交技术和PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单快速而得到广泛的应用其中以高通量、灵敏、特异、适用范围广和低成本为特点的快速检测方法受到越来越多的关注,而在这些方法中又以DNA检测为基础的各种分子生物学方法应用尤为广泛.同时,常规培养检测方法、基于免疫反应的检测方法等检测手段也在进一步地完善和改进.本文通过探讨目前常用食源性致病菌检测方法,对不同方法的优缺点进行阐述和分析.

常规食品微生物检测方法包括反复增菌、菌落分离及多种生化和血清学鉴别实验,食品中致病菌的常规培养检测方法灵敏、稳定、准确,并且检测结束后可获得目标致病菌,供后续研究,例如通过对从污染食品中检出的致病菌和从临床病人中分离的致病菌进行分析比较,并结合流行病学调查,可以揭示污染食品和病人之间是否存在关联,即是否是由于食用了污染食品而导致的临床病例的出现,从而为食品安全预警提供实验室的支持.正是由于这些优点,所以截至到目前,世界上很多国家仍将常规培养检测方法列为食品微生物检测的金标准,例如我国的国家标准GB4789食品微生物检测系列,美国食品药品管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)的细菌分析手册(BacteriologicaIAnalyticaIManual, BAM)等等.由此可见,食品中致病菌的常规培养检测方法是从事食品微生物检验的技术人员所必须掌握的最基础方法.如果能够在此基础上,结合一些以核酸分析为基础的快速检测方法,进行初步筛选,则可减少大量的工作,有效地提高检测效率.

酶联免疫吸附法( ELLISA)

酶联免疫吸附技术的基本原理是将抗原或抗体预先吸附于固相载体表面,再加入受检样品和酶标抗体,进行免疫酶染色,最后经固相载体上的酶催化产生颜色变化,从而判断受检样品是否含有目的抗原.同时通过分析有色产物量可以确定样品中待测物质的含量.例如沙门氏菌ELLISA法是将细菌经离心之后,转移到醋酸纤维薄膜上,然后放在多孔板中固定,加抗鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛抗体作用,再加第二酶标抗体作尉,最后以底物显色,产棕色或兰色为阳性.这种方法最小检出量可达lOcfu/mL~lOcfu/mL,其缺点是会引起假阳性反应.国内外学者采用酶联免疫吸附技术对不同的细菌进行检测,实验结果表明ELISA法对多种食源性致病菌的灵敏度和特异性较好.但ELISA对试剂的选择性高,很难同时分析多种成分,且对结构类似的化合物有交叉反应.许多学者把其他方法与免疫学方法结合起来以提高检测灵敏性,大大缩短了样品检测周期.

实时荧光定量PCR技术

荧光定量PCR是近年发展起来的一项新技术,现已广泛应用于生物及食品学科的众多领域,尤其在食品中致病微生物检测方面具有很大的应用价值.荧光定量PCR技术巧妙地利用了PCR技术核酸扩增的高效性,探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性以及计量高准确性等优点,同时又克服了普通PCR技术易污染、不能定量、探针杂交灵敏度不高、分离洗脱条件不易控制等不足,在致病菌基因诊断中有着广阔的应用前景.金大智等运用实时荧光PCR(Real-timePCR)技术建立对食品中单增李氏菌进行检测的快速方法,设计的引物和探针的序列特异性强,省去凝胶电泳的繁琐,降低了污染的可能性.以沙门氏菌的检测为例,杜邦公司BAX系统不但能检测到所有的沙门氏茵血清型,而且可以排除所有的非沙门氏菌菌株.在没有使用PCR技术之前,所有的增菌方法都需要大量的手工操作.检测人员操作技术差异,或因不断转移样品而导致样品发生交叉污染等原因,都会影响检测结果的准确性,甚至出现假阳性.根据致病菌的特异基因序列,设计引物,进行荧光定量PCR检测,是现阶段检测致病菌的最快速准确的方法.针对某种病原菌,采用传统的培养方法需要长达1星期的时间才能得到检测结果.而采用PCR技术,对绝大多数致病菌而言,在第二天就可以得到检测结果.结果更为准确、可靠,而且还可改进成定量竞争PCR,对标本中靶序列进行定量.实时PCR操作简单,闭管检测,减少污染,灵敏度高,并且可以在PCR结束或PCR过程进行同步定性或定量检测,而且可以进行大规模快速检测.

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致病菌:RVLM致病菌快速检测系统

食品中致病菌的快速定量、定性的检测是确保食品安全的前提,在该领域目前仍有许多问题需要解决,如提高分析灵敏度及重复性、降低自动化仪器和试剂成本、简化样品处理及多基因同时分析等.食源性致病菌检测技术在不断的发展和创新过程中,每种技术都有各自的优势.应该指出的是,快速检测方法的应用并不意味着完全抛弃分离培养方法.在某些情况下,特别是涉及一些需要最终结果的样品时,常规培养检测方法还是必不可少的,也是世界上公认的标准.

(作者单位:山东省青岛市黄岛区检验检测中心)

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